OncoGen 3D (Tumor Cell – DNA Free – Liquid Biopsy)

   

Da pochi anni è possibile ricercare, ed arricchire, frammenti di  DNA circolante senza cellule (ccfDNA) raccolto dal sangue, saliva o urine, capace di  eseguire una specie di “biopsia liquida” dei tumori solidi primari e metastatici, il cfDNA ha una straordinaria potenzialità per la rilevazione e il monitoraggio dei biomarcatori per il cancro.
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Rispetto al campionamento del DNA da un campione bioptico del tumore  il ccfDNA può fornire informazioni senza più ricorrere alla biopsia chirurgica ed è in grado di fornire, quante volte si vuole, senza nessuna invasività, le seguenti informazioni:

  • Presenza di ccfDNA circolante del cancro.
  • Mutazioni genetiche del cancro
  • Decisioni sulla terapia mirata sia alle mutazioni del cancro che a quelle che inducono resistenza.alle terapie geniche.

Il test è estremamente sensibile. Secondo quanto oggi ipotizzabile sarebbe in grado di rilevare DNA tumorale circolante molto tempo prima dell’insorgere della malattia ed a distanza di diversi decenni prima della eventuale morte del soggetto.

Questo aprirà la strada alla vera diagnosi precoce.

Benchè i tumori all’inizio siano talmente piccoli da poter essere individuati solo con la Biopsia Liquida (cell free DNA)  con il nostro metodo possiamo ricercare le mutazioni più frequenti correlate ad oltre 100 tipi di cancro.

I tumori che oggi sono studiati sono quelli solidi e, più di altri, vengono indagati sono quello polmonare, colon mammella e ovaio.

I Geni e i single-nucleotide variant (SNV) hotspots più frequentemente analizzati nel panel proposto sono:

 
Assay Geni indagati SNV hotspots selezionati
Polmone cfDNA Assay ALK, BRAF, EGFR, ERBB2, KRAS, MAP2K1, MET, NRAS, PIK3CA, ROS1, TP53 >150 hotspots che comprendono:
EGFR: T790M, C797S, L858R, Exon 19 del
KRAS: G12X, G13X, Q61X
BRAF: V600E
ALK: Exon 21-25
PIK3CA: E545K, H1047R, E542K
Colon cfDNA Assay AKT1, APC, BRAF, CTNNB1, EGFR, ERBB2, FBXW7, GNAS, KRAS, MAP2K1, NRAS, PIK3CA, SMAD4, TP53 >240 hotspots che comprendono:
KRAS/NRAS: G12/G13/Q61
BRAF: V600E
PIK3CA: E545K, H1047R
TP53: R175H R273H/C/L
Mutazioni deleterie ricorrenti APC ( p.R876*, p.R1114*, p.Q1378*, p.R1450*)
SMAD4: R361C/H
CTNNB1: S45F, T41A
Mammella/ovaio cfDNA Assay AKT1, EGFR, ERBB2, ERBB3, ESR1, FBXW7, KRAS, PIK3CA, SF3B1, TP53 >150 hotspots che comprendono:
PIK3CA: E545K, H1047R
AKT1: E17K
ESR1: mutazioni associate alla resistenza agli estrogeni
TP53: mutazioni associate alla perdita di funzione
ERBB2 mutazioni associate alla sensibilità alle terapie anti-ERBB2

Nel nostro Istituto è però possibile ricercare tutte le mutazioni specifiche personalizzate.

Come si procede?

Per prima cosa si raccoglie una quantità di circa 10 cc di sangue del soggetto da esaminare e si conserva il plasma in provette apposite capaci di garantire stabilità a DNA circolante per un periodo sufficiente affinché questo arrivi al laboratorio prescelto. In genere la capacità di conservazione non supera però i 7 giorni. Di tali provette con soluzione stabilizzante e conservante ve ne sono solo alcuni tipi in commercio ( Streck Blood ccfDNA Tubes; PAXgene Blood ccfDNA Tubes ecc)

Il flusso di lavoro inizia con una fase di centrifugazione che separa il plasma dalla frazione cellulare del sangue intero raccolto in nei Blood ccfDNA Tubes. Il plasma viene quindi accuratamente trasferito in un secondo tubo. Una seconda fase di centrifugazione può essere effettuata opzionalmente per rimuovere eventuali tracce di cappotto buffy. Il plasma puro viene poi trasferito in un terzo tubo che viene caricato nella cartrige.

Qui le proteine plasmatiche vengono digerite mediante proteina K mentre il ccfDNA si lega alla superficie dei vettori Vengono isolati frammenti ccfDNA prevalentemente piccoli o piccoli e grandi frammenti ccfDNA . Diversi passaggi di lavaggio assicurano la rimozione dei contaminanti. Infine, il ccfDNA viene eluso dai vettori ed è pronto per essere utilizzato nelle applicazioni di Sequenziamento.
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APPROFONDIMENTO 1:

Questa tecnologia ha enormi implicazioni diagnostiche e terapeutiche in oncologia si ritiene stia oramai trasformando la pratica clinica. Il sequenziamento del genoma di un tumore per informare sulle decisioni di trattamento è già centrale per la gestione di molti pazienti con cancro e ho assistito a questo cambiamento che è il segno distintivo della cura del cancro. La terapia su misura si basa sull’identificazione del giusto target tumorale molecolare. Attualmente, il tessuto bioptico tumorale, generalmente dal tumore primario, viene utilizzato per determinare gli obiettivi molecolari in un solo punto temporale, prima che il trattamento cominci. Queste biopsie portano dei rischi per i pazienti, sono dolorosi, sono costosi e, soprattutto, il processo richiede tempo. Inoltre, data la complessità dell’eterogeneità tumorale, sia all’interno di un tumore che tra un tumore primario e le metastasi, un campione di tessuto potrebbe non essere una vera rappresentazione del profilo molecolare. Una biopsia liquida, d’altra parte, può catturare l’intera eterogeneità della malattia. Inoltre, i genotipi tumorali sono notoriamente instabili e soggetti a cambiamenti continui. A questo proposito, le biopsie liquide offrono ciò che le biopsie dei tessuti non possono, a causa dei rischi per i pazienti e dei costi; L’opportunità di prendere campioni seriali per monitorare i cambiamenti genomici tumorali in tempo reale. Ciò permetterà ai medici di assicurare che la terapia che abbiano selezionato, basandosi su un determinato target molecolare, resta pertinente e osserva l’emergere di qualsiasi resistenza. Invece di aspettare informazioni dalle sezioni anatomiche o dalle limitate tecniche di imaging, possiamo essere in grado di identificare in una fase precedente se un trattamento non funziona e di risparmiare il paziente la tossicità inutile di un farmaco che non fornisce più alcun beneficio. Allo stesso tempo, possiamo osservare se si manifestano nuovi target molecolari che potrebbero essere adatti per il trattamento. Tutto ciò potrebbe aiutare a fornire ai pazienti il ​​giusto trattamento per il bersaglio giusto senza indugio.

Le biopsie liquide ci presentano anche con un’occasione unica per andare avanti con la nostra comprensione dello sviluppo delle malattie metastatiche e possono aiutare a identificare i percorsi di segnalazione coinvolti nell’invasività cellulare e nelle competenze metastatiche. Già oggi, in molti centri , questi test vengono addirittura utilizzati nella diagnosi del cancro, soprattutto nei soggetti a rischio. Questo rivoluzionerà la cura del cancro, fornendo ai medici un rapido accesso alle informazioni a livello molecolare alla diagnosi, ottimizzando così le scelte di trattamento.

In passato sono stati studiate a lungo le cellule circolanti tumorali (CTC). Esse, solo recentemente e con le più moderne tecnologie oggrono risultati promettentii. Finora hanno fornito scarsi risultati perchè sono cellule relativamente rare e richiedono una tecnologia sensibile di raccolta e di arricchimento, forniscono informazioni sia a livello genetico che cellulare. Oggi il DNA del tumore senza cellule (cfDNA) sta emergendo come la più richiesta tecnica di studio e monitoraggio dei pazienti affetti da tumori solidi. Fino ad ora sono stati un’alternativa efficace ai CTC raccolte con i metodi tradizionali (vedi invece ultime tecnologie nella sezione dedicata ) , con i vantaggi della raccolta e dell’analisi più facili.

Sappiamo che la standardizzazione sarà un fattore chiave per garantire la coerenza tra i centri e per determinare il suo successo clinico. È fondamentale standardizzare i saggi utilizzati per valutare il cfDNA e definire anche il campione ottimale di campionamento (siero o plasma). Infatti la normalizzazione in tutto il consiglio sarebbe ideale: raccolta del sangue, elaborazione, stoccaggio e estrazione del DNA, quantificazione, analisi e segnalazione dei dati. Lo sviluppo futuro delle biopsie liquide dovrà fornire un’analisi economica, soprattutto identificando i geni notoriamente ricorrenti mutati in ogni tumore. Pertanto, lo sviluppo di metodologie standardizzate per l’analisi e la convalida cfDNA nei grandi studi prospettici clinici è obbligatorio per l’attuazione dell’approccio bioptico liquido nella gestione clinica dei pazienti affetti da tumore.

Nel campo dell’oncologia, vediamo tante innovazioni che vengono e vanno, senza un impatto duraturo. La promessa delle biopsie liquide è invece una realtà clinica. Come sono una realtà le terapie che da queste tecnichew vengono scelte e guidate.

APPROFONDIMENTO 2

Le biopsie liquide sono sempre più comuni nella ricerca traslazionale per identificare l’eterogeneità tumorale, monitorare l’evoluzione del genoma tumorale nel tempo e identificare la recidiva tumorale e la prossima resistenza, che porta ad un cambiamento di trattamento. I clinici stanno ora utilizzando biopsia liquida – o sequenziamento mirato di DNA senza cellule circolanti – perché richiede un piccolo campione di sangue dal paziente che può essere facilmente recuperato, anche quando l’intervento chirurgico è impossibile (ad esempio tumori cerebrali). Tipicamente, i benefici della biopsia liquida sono compensati dalle difficoltà intrinseche dell’analisi dei dati, che richiede l’identificazione di varianti (molto frequenti) a un livello dell’1% e inferiore.
Per ottenere risultati validi clinicamente bisogna disporre di impostazioni ottimali dei parametri nel flusso di lavoro completo, per facilitare l’identificazione e l’ispezione delle potenziali ed individuare potenziali varianti patogene e funzionali del cancro. I campioni di diversi pazienti possono essere confrontati.
La rilevazione di varianti patogentiche è fondamentale nelle applicazioni ccfDNA. Tuttavia, a causa di limiti nella copertura dell’analisi allelica possono perdersi dei dati significativi.
Vanno quindi prese in considerazione tutte le varianti patogenetiche disponibili e testare nel campione ccfDNA anche le più piccole quantità di sequenze che leggono le varianti patogenetiche.
L’identificazione di nuove potenziali varianti del cancro è difficile da cfDNA poichè le varianti sono attese ad un livello dell’1% e inferiore. Le analisi più approfondite consentono di individuare le varianti a un livello dell’1% e inferiore utilizzando la vasta letteratura disponibile.